牛病毒性腹泻病毒（BVDV）核酸检测试剂盒说明书

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

【产品名称】

商品名称：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name：  Bovine Viral Diarrhea Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测的牛的组织样品、鼻拭子等标本中牛病毒性腹泻病毒核酸，适用于牛病毒性腹泻病毒   感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对牛病毒性腹泻病毒特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对牛病毒性腹泻病毒的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

组织样品：用无菌剪刀、镊子采集待检脏器或组织。可采集肠粘膜刮取物或肺、脾、淋巴结等作为待检组织样品；对流产胎牛、死胎，直接采集胎儿的组织；对怀疑死于粘膜病的牛，可采集xue块或肺、脾、淋巴结等组织，尤其是肠道集合淋巴组织，如肠道样品已发生自溶，可采扁桃体和淋巴结。将采集的样品装入无菌采样袋或其他灭菌容器，编号备用；鼻拭子：对疑似为急性感染期或持续感染的牛，采集鼻分泌物拭子。取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回擦拭 2 次~3 次并旋转，取分泌物；将采样后的拭子放入盛有 2.0 mL PBS 的采样管中，编号备用。

其它样本采集请参考 GB/T 18637-2018 《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.  样品处理（样本处理区）

1.1  样本前处理

组织样品：用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 2.0g 于研钵或组织匀浆器中充分研磨，再加 10.0mLPBS 混匀，

2000r/min 离心 5 min 后，取 1.0ml 上清液转入无菌 1.5mL 灭菌离心管中，编号备用。

鼻拭子：用含 1000U/mL 青霉素和链霉素的细胞培养液 4 倍稀释后，2000r/min 离心 15min 取上清液，编号备用。

其他样本前处理请参考 GB/T 18637-2018 《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》。

1.2  核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按    照试剂说明书进行操作。

2.  试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满

10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。

3.  加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.  PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1  将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2  设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择

ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3  推荐循环参数设置：

5.1  结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2  结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3  质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.  检测方法的局限性

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1. 所有操作严格按照说明书进行；

2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，wan全混匀并短暂离心；

3. 反应液应避光保存；

4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 中华人民共和国农业农村部(2018).GB/T 18637-2018.国家市场监督管理总局;中国国家标准化管理委员会.