牛腺病毒3型(BAV-3)核酸检测试剂盒说明书

【产品名称】

通用名称：牛腺病毒3型(BAV-3)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法) 

Name   ：Bovine Adenovirus Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

牛腺病毒3型（BAV-3）是引起牛呼吸道疾病的主要病原体之一，特别是新生犊牛。临床症状包括发烧，呼吸困难，鼻腔和眼结膜有分泌物等。病理变化主要举行阿玉肺部，具有鲜明的肺小叶wei缩、肺气肿和突变。血清学调查表明该病广泛分布于世界各地，给养牛业造成巨大经济损失。

本试剂盒适用于检测肺组织、呼吸道及眼鼻分泌物等样本中的牛腺病毒3型，用于牛腺病毒3型感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，根据牛腺病毒3型基因保守区设计特异性引物和探针，用荧光PCR技术对牛腺病毒3型的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

注：不同批号试剂不能混用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】

捕杀牛：取肺部病变组织，5g；活牛：用灭菌棉拭子沾取牛气管或眼鼻分泌物，然后置于装有0.5mL生理盐水的离心管中。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；棉拭子：直接取100μL于1.5mL灭菌离心管中。

1.2 DNA提取

1) 对上述处理好的标本加入50μL核酸提取液，100℃恒温处理10min，13,000 rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；

2) DNA的提取也可以采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的DNA提取试剂盒（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择ROX参比荧光。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.1 结果判断

阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道35<Ct值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为35<Ct值≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果Ct值>38或无Ct值。

6. 质控标准

阴性质控品：Ct>38或无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，wan全混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 于作. 牛腺病毒3型中国分离株的鉴定及全基因组序列分析[J]. 中国农业科学院, 2011.