红霉素-N-脱甲基酶（ERND）活性测定试剂盒说明书

红霉素-N-脱甲基酶（ERND）活性测定试剂盒说明书

                                                      微量法 100T/48S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用。ERND在P450酶系中相当于CYP2B亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使某些药物经CYP2B代谢活化。

测定原理：

ERND催化红霉素释放甲醛，通过Nash比色测定甲醛含量，即可计算出ERND活性。

自备仪器和用品：

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水和冰。

试剂组成和配置：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1管，4℃保存。临用前加1mL蒸馏水，充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加0.5mL蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前，加蒸馏水4.5mL充分溶解。

试剂六：液体×1瓶，4℃保存。

试剂七：液体×1瓶，4℃保存。

标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取1.5mL EP 管，加入10μl标准液，加990μl蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体：100 000g，4℃，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30 min。

3. 对照管：取0.5mL EP管，加入10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取新的EP管，加入100μL上清液，100μL试剂七，混匀后60℃

水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A对照管。

4. 测定管：取0.5mL EP管，加入10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL试剂四，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取新EP管，加入100μL上清液，100μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A测定管。

5. 标准管：取0.5mL EP管，加入100μL标准品，100μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A标准管。

注意：每个样品都需要做对照管。

ERND活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按照蛋白浓度计算:

活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×（A测定管－A对照管）÷A标准管×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T

= 45×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷Cpr。

(2). 按照样本质量计算:

活性单位定义：37℃下，每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/g 鲜重) = C标准品×V标准品×（A测定管－A对照管）÷A标准管×稀释倍数÷（W×V样）÷T

= 45×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷W

C标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：100μL=1×10^-4 L；稀释倍数：V反总÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V样：加入粗酶液体积，10μL=0.01mL；T：催化反应时间（min），30min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按照蛋白浓度计算:

活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×（A测定管－A对照管）÷A标准管×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T

= 45×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷Cpr。

(2). 按照样本质量计算:

活性单位定义：37℃下，每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/g 鲜重) = C标准品×V标准品×（A测定管－A对照管）÷A标准管×稀释倍数÷（W×V样）÷T

= 45×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷W

C标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：100μL=1×10^-4 L；稀释倍数：V反总÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V样：加入粗酶液体积，10μL=0.01mL； T：催化反应时间（min），30min。