天冬酰胺合成酶(AS) 活性测定试剂盒说明书

天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase，AS) 活性测定试剂盒说明书

                                      微量法100管/96样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

天冬酰胺合成酶是广泛存在于生物体内的一类氨基转移酶，催化谷氨酞胺的氨基向天冬氨酸转移。当植物处于氨毒时天冬酞胺的形成是一种解毒反应。

测定原理：

AS催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。

需自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

试剂组成和配制：

试剂一×2瓶，60 mL，4 ℃保存；

试剂二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；

试剂三×1瓶，60 mL，常温保存；

试剂四×1瓶，5 mL，常温保存；

试剂五×1瓶，3 mL，常温保存；

试剂六×1瓶，3 mL，常温避光保存。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零。

2、样品测定（在EP管中加入下列试剂）：

混匀，37℃水浴1 小时

混匀，8000 g，25℃离心10 min；取上清液，在EP管或96孔板中加入下列试剂

混匀，室温静置15min，420nm处读取测定管和对照管吸光值，计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

注意：试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。

酶活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.662x -0.0434；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值A。

1、血清（浆）AS活性

单位定义：每mL血清（浆）每小时产生1μg 氨定义为一个酶活力单位。

AS（μg/h/mL）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反总÷V样÷T=31.722×(ΔA+0.0434)

2、组织、细菌或细胞中AS活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1μg 氨定义为一个酶活力单位。

AS活力（μg/h/mg prot）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反总÷(V样×Cpr)÷T =31.722×(ΔA+0.0434) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每小时产生1μg氨定义为一个酶活力单位。

AS活力（μg/h/g 鲜重）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T =31.722×(ΔA +0.0434) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1μg 氨定义为一个酶活力单位。

AS活力（μg/h/10⁴ cell）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V反总÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.0634×(ΔA+0.0434)

T：反应时间，1h； V反总：反应体系总体积：0.525mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.025mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量， g；500：细菌或细胞总数，500万

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.3046x -0.0097；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值A。

1、血清（浆）AS活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）每小时产生1μg 氨定义为一个酶活力单位。

AS活力（μg/h/mL）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反总÷V样÷T=68.94×(ΔA +0.0097)

2、组织、细菌或细胞中AS活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1μg 氨定义为一个酶活力单位。

AS活力（μg/h/mg prot）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反总÷(V样×Cpr)÷T =68.94×(ΔA +0.0097) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每小时产生1μg氨定义为一个酶活力单位。

AS活力（μg/h/g 鲜重）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T =68.94×(ΔA +0.0097）÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1μg 氨定义为一个酶活力单位。

AS活力（μg/h/10⁴ cell）＝(ΔA+0.0097) ÷0.3046×V反总÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.1379×(ΔA +0.0097)

T：反应时间，1h； V反总：反应体系总体积：0.525mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.025mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量， g；500：细菌或细胞总数，500万。