α-淀粉酶（α-amylase，α-AL）试剂盒说明书

α-淀粉酶（α-amylase，α-AL）试剂盒说明书

                                        微量法100管/48样

注    意：正式测定前请取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。

测定原理：

淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在540 nm有吸收峰；通过测定540 nm吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。α-AL耐热，但是β-淀粉酶可在70℃钝化15min。因此粗酶液经过70℃钝化15min，就只有α-AL能够催化淀粉水解。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体15mL×1瓶，室温保存。若有黄色晶体析出，可90℃加热溶解后再用。

试剂二：液体7.5mL×1瓶，4℃保存。若有沉淀析出，可70℃加热溶解后使用。

粗酶液提取：

组织：称取0.1~0.2g样本（建议称取约0.1g样本），加1 mL蒸馏水匀浆；将匀浆倒入离心管中，在室温下放置提取15min，每隔5min振荡1次，使其充分提取；3000g，25℃离心10min，吸取上清液并且加蒸馏水定容至10 mL，摇匀，即为淀粉酶原液。

血清（浆）：直接检测。

操作步骤和加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：

1、   分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长到540 nm，蒸馏水调零。

2、   试剂一和试剂二40℃预热10min。

3、测定步骤：

70℃水浴15min左右，流水冷却。

在40℃恒温水浴中准确保温5min

混匀，95度水浴5min，冷却，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm处读取吸光值，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

α-淀粉酶活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归曲线为y=3.7215x -0.1778； x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、α‑淀粉酶活性

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.075×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷（V样×Cpr）÷T=0.1075×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（浆）样本中α‑淀粉酶活性计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T=0.1075×(ΔA＋0.1778)

反总：反应体系总体积，0.15mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；V样总：提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归曲线为y=2.481x -0.1778； x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、α‑淀粉酶活性

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α‑淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷（V样×Cpr）÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（浆）样本中α‑淀粉酶活性计算

单位定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α‑淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷V样÷T=0.1612×(ΔA＋0.1778)

V反总：反应体系总体积，0.15mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；V样总：提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。