甲醛脱氢酶（Formaldehyde Dehydrogenase，FDH）试剂盒说明书

甲醛脱氢酶（Formaldehyde Dehydrogenase，FDH）试剂盒说明书

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物，对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶（ADH）的家庭成员之一，广泛存在于原核和真核生物中，该酶能利用NAD⁺作为辅酶，将有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途径中的关键酶。

测定原理：

甲醛脱氢酶催化甲醛和NAD⁺产生NADH，在340nm处的吸光值会增加，测定340nm处的吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。

自备实验用品及仪器：
天平、离心机、酶标仪、96孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入6mL水溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1支，4℃保存；临用前加入1.5mL水溶解待用。

试剂四：液体1.5mL×1支，4℃避光保存。

FDH提取：

1.        组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心20min。

2.        细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.        液体：直接检测。

测定操作表：

1、   酶标仪预热30min，调节波长至340nm。

2、   操作表

在96孔板中加入如下试剂

混匀，于340nm下测定初始吸光值A1与5min后的吸光值A2，△A=A2-A1。

若样本数量较多，可将试剂按比例配成工作液使用。

FDH酶活计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD⁺的酶量为1个酶活单位。

FDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T = 643×△A÷Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：每克样品每分钟催化还原1nmol NAD⁺的酶量为1个酶活单位。

FDH酶活（nmol/min/g 鲜重）= ×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T =643×△A÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每分钟催化还原1nmol NAD⁺的酶量为1个酶活单位。

FDH酶活（nmol/min/10⁴cell）= ×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T= 643×△A÷细胞数量

（4）按液体体积计算

酶活定义：每mL样本每分钟催化还原1nmol NAD⁺的酶量为1个酶活单位。

FDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反总÷V样÷T=643×△A

：NADH微摩尔消光系数，6.22×10^-3 L/µmol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T，反应时间，5min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g