葡萄糖-6-磷酸( Glucose 6-phosphate， 6P G)含量测定试剂盒说明书

葡萄糖-6-磷酸( Glucose 6-phosphate， 6P G)含量测定试剂盒说明书

                                            微量法 100管/48样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

6PG (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸，又称6-磷酸葡萄糖)，是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物，广泛存在于动植物体和微生物中。在糖酵解的第一步反应中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸，以继续糖酵解的其它步骤；而在戊糖磷酸途径中，葡萄糖-6-磷酸是其第一个底物，该过程也是生成NADPH的主要途径。此外，葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被储存起来。

测定原理：

6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色，在450 nm下测定吸光值。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体60 mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体12mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体1.5mL×1管， 4℃避光保存。

6PG提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）， 8000g，25℃离心10min，取上清待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，8000g，25℃离心10min，取上清待测。

3、血清（浆）等液体样品：直接测定。

测定步骤：

1、酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm。

2、试剂二的配制：临用前加入3mL水充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存；

3、工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液

4、样本测定

按下表在96孔板中加入如下试剂

37℃避光孵育30min，450nm下测定吸光值A测定与A对照，△A=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

6PG含量计算：

1、标准条件下测定回归方程为y = 3.8589x - 0.0016，R2 = 0.997； x为6PG含量（μmol/mL），y为吸光值。

2、按照血清（浆）体积计算

6PG含量（nmol/mL）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷V1×1000

=259.1×(△A+0.0016)

3、按照蛋白浓度计算

6PG含量（nmol/mg prot）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(V1×Cpr)×1000

=259.1×(△A+0.0016) ÷Cpr

4、按照样品质量计算

6PG含量（nmol/g鲜重）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(W ×V1÷V2）×1000

=259.1×(△A+0.0016) ÷W

3、按照细菌或细胞密度计算

6PG含量（nmol/104 cell）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷（500×V1÷V2）×1000

=0.518×(△A+0.0016)

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；1000，μmol到nmol的换算系数。