抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定试剂盒说明书

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定试剂盒说明书

                                               微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H₂O₂氧化AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX的活性直接影响到AsA的含量，APX与AsA具有一定的负相关性。

测定原理：

APX 催化H₂O₂氧化AsA，通过测定AsA氧化速率，来计算得APX活性。

自备仪器用品：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加3 mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体3mL×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。

测定：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长到290nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂一在25℃中预热30min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL预热的试剂一20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在290nm测定10s和130s光吸收A1和A2，△A=A1-A2。

APX活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)  按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反总×10⁹÷(Cpr×V样)÷T

=1786×△A÷ Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：每g组织每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

APX(nmol/min/g 鲜重 ) = △A÷(ε×d）×V反总×10⁹÷(W×V样÷V样总)÷T

=1786×△A ÷W

ε：AsA在290nm处摩尔吸光系数为2.8×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：催化反应时间（min），2min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1)  按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V反总×10⁹÷(Cpr×V样)÷T

=3571×△A÷ Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：每g组织每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

APX(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V反总×10⁹÷(W×V样÷V样总)÷T

=3571×△A ÷W

ε：AsA在290nm处摩尔吸光系数为2.8×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：催化反应时间（min），2min。

注意事项：

配制好的试剂二4℃保存，并且3天内使用完。