还原型抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）含量测定试剂盒说明书

还原型抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）含量测定试剂盒说明书

微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

AsA又称维生素C。AsA是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂，AsA在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻重的作用，也是衡量农作物产品品质的重要指标之一。

测定原理：

 在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰肼–2–羟基丁酰内酯衍生物，在最大吸收波长420处测定吸光度。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低 温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体4mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体6mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×2瓶（棕色），4℃避光保存。临用前配制，每瓶加入7 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂4℃下可保存3天。

样品中AsA提取：

1.        组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g，4℃离心20min，取上清液置冰上混匀待测。

3.  血清等液体：直接测定。

AsA测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到420 nm，蒸馏水调零。

2.在EP管中加入下列试剂

混匀，25℃静置20min，吸取200µL加入微量石英比色皿/96孔板中，420nm下测定各管吸光值。ΔA=A测定-A空白。

注意：标准管只需测定一次。

AsA含量计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线y = 0.0088x - 0.018 ，R2 = 0.9978

(1). 按蛋白浓度计算

AsA (μg/mg prot) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V样÷（Cpr×V样）

=113.63×(ΔA+0.018)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AsA(μg/g 鲜重) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V样÷(W×V样÷V样总)

=113.63×(ΔA+0.018)÷W

(3). 按细胞数量计算

AsA(μg/10⁴ cell) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)

=113.63×(ΔA+0.018)÷细胞数量

（4）按液体体积计算

AsA (μg/mL) =(ΔA+0.018)÷0.0088

=113.63×(ΔA+0.018)

V样：加入样品体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1.0 mL; Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量（g）。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线y = 0.0044x - 0.018 ，R2 = 0.9978

(1). 按蛋白浓度计算

AsA (μg/mg prot) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V样÷（Cpr×V样）

=227.27×(ΔA+0.018)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AsA(μg/g 鲜重) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V样÷(W×V样÷V样总)

=227.27×(ΔA+0.018)÷W

(3). 按细胞数量计算

AsA(μg/10⁴ cell) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)

=227.27×(ΔA+0.018)÷细胞数量

（4）按液体体积计算

AsA (μg/mL) =(ΔA+0.018)÷0.0044

=227.27×(ΔA+0.018)

V样：加入样品体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1.0 mL; Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量（g）。

注意事项：

试剂三现配现用，配制好的4℃保存，3天内使用完。