脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）试剂盒说明书

脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）试剂盒说明书

                                                   微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

DHAR存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR催化GSH还原DHA生成AsA和GSSG，调控细胞AsA/DHA比值，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA含量，进而提高植物食品的营养品质。

测定原理：

DHAR催化GSH还原DHA生成AsA，通过测定DHA减少速率，计算DHAR活性。

实验中所需仪器及设备：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体17.5mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶（棕色），4℃保存。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取：

1.        按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g 4℃离心20min，取上清液置冰上混匀待测。

3.  血清等液体：直接测定。

DHAR测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL试剂三、20μL试剂四和140μL 试剂二，最后加20μL上清液迅速混匀后于265nm比色，记录30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A2-A1。

DHAR活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷(Cpr×V样)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷(W×V样÷V样总)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

= 92×△A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷V样÷T

= 92×△A

ε ：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：比色杯光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L；V样：反应体系中加入上清液体积，20μL =0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W ：样品质量；T：反应时间，2 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷(Cpr×V样)÷T

= 184×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷(W×V样÷V样总)÷T

= 184×△A ÷W

(3). 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

= 184×△A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷V样÷T

= 184×△A

ε ：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L；V样：反应体系中加入上清液体积，20μL =0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W ：样品质量；T：反应时间，2 min。

注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的4℃保存，3天内使用完。