L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（Gal LDH）活性测定试剂盒说明书

L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（Gal LDH）活性测定试剂盒说明书

                                                微量法 100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

L-半乳糖途径是合成AsA的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜，负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。

测定原理：

Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原细胞色素C(Cyt c)，还原型Cyt c在550nm有吸收峰；测定还原型Cyt c增加速率，来计算Gal LDH活性。

自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶（棕色），4℃保存。临用前加入16mL蒸馏水，充分溶解。

试剂三：粉剂×1管，4℃保存。临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解。

粗酶液提取：

照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

Gal LDH测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到550nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3.依次在、微量玻璃比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值A1和A2，△A = A2﹣A1。

Gal LDH活性计算公式：

使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

Gal LDH活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原1nmol Cyt c 为1个酶活单位。

Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷（Cpr×V样）÷T

=578×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

Gal LDH活性单位定义：25℃中每克样品每分钟还原1nmol Cyt c 为1个酶活单位。

Gal LDH (nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷（W×V样÷V样总）÷T

=578×△A ÷W

ε：还原型Cyt c摩尔消光系数，17.3×10³L/ mol/cm；d：96孔板光径(cm)，0.5cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=0.0002 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；T：反应时间，2min。

注意事项:

试剂二和试剂三配制好后3天内使用完。