查尔酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)试剂盒说明书

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)试剂盒说明书

                                          微量法 100管/96样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                     

测定意义：

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)是第一个被认识的黄酮类化合物合成相关酶，也是黄酮代谢途径中的关键酶之一。查尔酮异构酶和查尔酮合酶一起构成了黄酮类化合物生物合成的限速酶。

测定原理：

查尔酮异构酶（CHI）催化查尔酮环化形成 4,5,7-三羟基黄烷酮，通过测定381nm下的吸光度变化表示CHI的活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；用时加入20mL试剂一充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至381nm，蒸馏水调零。

2、  样本测定表

在微量石英比色皿或96孔板中加入10µL上清液和190µL试剂二，立即混匀并记录381nm下初始吸光值A1和37℃保温30min后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

CHI活性计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每小时A381变化0.1为一个酶活力单位。

CHI（U/mg prot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.1÷T =400×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织在每mL反应体系中每小时A381变化0.1为一个酶活力单位。

CHI（U/g 鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.1÷T =400×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，0.2mL； V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

用96孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每小时A381变化0.05为一个酶活力单位。

CHI（U/mg prot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.05÷T =800×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织在每mL反应体系中每小时A381变化0.05为一个酶活力单位。

CHI（U/g 鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.05÷T =800×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，0.2mL； V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。