多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）试剂盒说明书

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）试剂盒说明书

                                      微量法100管/48样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：                           

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

测定原理：

PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：20mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：5mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）或果汁样本的处理：

按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。

2、  样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）

37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，95℃水浴5min，冷却至室温，10000g，25℃离心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。

注意：煮沸样本的操作：取300μL离心上清于EP管中，进行5min 95℃水浴处理；每个测定管需要设一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行5min 95℃水浴处理。

PPO活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）或果汁PPO活性

单位的定义：每分钟每mL血清（浆）或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化

0.01为一个酶活力单位。

PPO（U/mL）=ΔA×V反总÷(V液× V样÷V样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液

2、组织、细菌或细胞PPO活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个

酶活力单位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个

酶活力单位。

PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.3mL；V液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1mL； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）或果汁PPO活性

单位的定义：每分钟每mL血清（浆）或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化

0.005为一个酶活力单位。

PPO（U/mL）=ΔA×V反总÷(V液× V样÷V样总)÷0.005÷T =120×ΔA÷V液

2、组织、细菌或细胞PPO活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个

酶活力单位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个

酶活力单位。

PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.005÷T =120×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T =0.24×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.3mL；V液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1mL； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。