过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒(钼酸铵比色法)说明书

过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒(钼酸铵比色法)说明书

微量法100管/96样

测定意义：                           

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

测定原理：

过氧化氢能氧化MoO₄^2-成MoO₅^2-,MoO₅^2-接受氢氧根的电子成键，分子间立即脱水缩合，得到稳定的黄色复合物(H₂MoO₄·XH₂O)_n在405nm处有强烈吸收峰，其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体100 mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体10 mL×1瓶，4℃避光保存；

试剂二：液体25 mL×1瓶，常温保存；

试剂三：液体60 mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、   酶标仪预热30min以上，调节波长至405 nm。

2、在EP管中加入下列试剂

CAT活性计算：

1、标准曲线：y = 0.09x + 0.0013      R² = 1      x：体系中过氧化氢浓度变化值（μmol/mL）

                                          y：吸光值差值ΔA

2、血清（浆）CAT活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷V样÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)

3、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷(V样×Cpr) ÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化1μmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷（W× V样÷V样总）÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷W

V反总：反应体系总体积，0.8 mL；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

注意事项：

1、   预实验若发现酶活性过高（A测定＜0.1），可用提取液适当稀释样品后测定，并在计算公式中乘以相应稀释倍数。

2、   若A空白＜A测定，一方面可能是酶活性过低，可将反应时间2延长到5min,另一方面可能样本中杂质干扰严重，可将样本稀释5倍左右后测定，并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。