鸡毒支原体(MG)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
商品名称:鸡毒支原体(MG)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name :Mycoplasma gallisepticam Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)是引起鸡慢性呼吸道疾病的主要病原,引起鸡呼吸道粘膜卡他性炎症,造成肉鸡胴体品质下降,种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等。MG 是高度传染性病原,可随尘粒、空气和羽毛在鸡群中水平传播,也可随种蛋垂直传播。MG 定植鸡的呼吸道后,导致呼吸道上皮细胞纤毛活动减弱或停滞,引起鸡群继发大肠杆菌感染或鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒感染,引起严重的并发症,导致鸡群死亡率增高,给养鸡业造成严重的经济损失。
本试剂盒适用于检测鼻腔、眶下窦、气管或气囊组织、眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物、鼻腔、食 管、气管、泄殖腔和交合器拭子、卵黄囊内表面等样本中的鸡毒支原体,用于鸡毒支原体感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒对鸡毒支原体基因保守区设计特异性的引物和探针,用荧光 PCR 技术对鸡毒支原体的核酸进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格50T/盒
MG 反应液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
MG 阳性质控品50μL ×1 管
阴性质控品250μL ×1 管
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
病死或扑杀禽,从鼻腔、眶下窦、气管或气囊取样,也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物;活 禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样;鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。
【保存和运输】
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。
【使用方法】
1.样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL灭菌离心管中;液体样品,直接取 100μL 提取。
1.2核酸提取
推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取试剂(离心柱法)进行核酸提取,请按照试剂说明书 进行操作。
2.试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂MG 反应液酶液
用量(样本数为 N)19μL1μL
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL/管。
3.加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。
4.PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3推荐循环参数设置:
步骤循环数温度时间收集荧光信号
11 cycle95℃2min否
245 cycles95℃15sec否
60℃30sec是
5.结果分析判定
5.1结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500 仪器为例)
反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤40,且曲线有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3质控标准
阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
6.检测方法的局限性
样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.所有操作严格按照说明书进行;
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完-全混匀并短暂离心;
3.反应液应避光保存;
4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【生产企业】
企业名称:优利科(上海)生命科学有限公司
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