鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)说明书

【产品名称】

通用名称：鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

Name ：Duck Plague Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

鸭瘟，又称鸭病毒性肠炎，是由疱疹病毒科鸭瘟病毒（Duck Plague Virus, DPV） 引起的一种急性（有时呈慢性）鸭、鹅和天鹅接触性传染病。其特征为体温升高，两腿麻痹，下痢，流泪和部分病鸭头颈肿大。食道粘膜有小出血点，并有灰黄色假膜覆盖或溃疡，泄殖腔粘膜充血出血水肿和假膜覆盖。肝有不规则大小不等的出血点和坏死灶[1]。本病传播迅速，发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业发展。

本试剂盒适用于检测病鸭血液、口腔伪膜及溃疡处粘液、肝、脾、肾等组织样品   等样本中的鸭瘟病毒，用于鸭瘟病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对鸭瘟病毒基因组保守区设计特异性引物和探针[1-3]，用荧光 PCR 技术对鸭瘟病毒的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名称规格

酶液50μL×1 管

DPV 反应液500μL×2 管

DPV 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

注：

1）不同批号试剂不能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列

荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

在发病早期，无菌采集病鸭血液或刮取口腔伪膜及溃疡处粘液；在动物死亡后，

无菌采取肝、脾、肾等组织样品

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本

运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；粘液直接取 100μL 提取

1.2DNA 提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 DNA 提取试剂盒（离心柱提取

法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂DPV 反应液酶液

用量（样本数为 N）20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye） NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38， 且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定   量检测不准确的结果；

本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

所有操作严格按照说明书进行；

试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

反应液应避光保存；

反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通   则》进行处理。

【参考文献】

[1]国家质量监督检验检疫总局. SN/T-2744-2010 鸭病毒性肠炎检疫技术规范[S]. 北京: 科学出版社, 2010.

[2]索化夷, 汤承, 岳华, 等. 实时荧光定量TaqMan-PCR 检测鸭瘟病毒方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2006.

[3]马腾飞. 鸭瘟病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及其强弱毒株 UL2 基因差异分析[J]. 山东农业大学, 2015.