转基因大米Bt（cryAc）荧光PCR试剂盒

转基因大米Bt（cryAc）荧光PCR试剂盒

【产品名称】

通用名称：转基因大米Bt（cryAc）荧光PCR试剂盒

Name  ：Transgenic Rice Bt (CryAc) Gene Detection Kit (Real-Time PCRMethod)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测转基因大米Bt（CryAc)基因，用于筛查待检测植物中是否含有CryAc成分。其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒用国家标准的CryAc特异性引物和探针，用荧光PCR 技术进行转基因成分的检测。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃避光保存、运输、避免反复冻融，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】

称取200g样品。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

固体样本：用粉碎机或冷冻研磨仪将样品研磨至细粉状。

1.2 DNA提取

对于固体标本，DNA的提取可以采用SN/T 2584-2010中推荐的方法：

1) 每个样品取2个平行管。称取200mg粉碎的样品，加入1mL预冷至4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静止5min，4℃条件下10000g离心15min，弃上清液；

2) 加入600uL预热至65℃的裂解液，充分重悬沉淀，在65℃恒温保持40min，期间颠倒混匀5次；

3) 室温条件下10000g离心10min，取上清液转移至新离心管中，加入5uLRNAseA，37℃恒温30min，分别用等体积苯/酚：异戊醇溶液和三氯jia烷：异戊醇溶液各抽提一次；

4) 室温条件下，10000g离心10min，取上清液至新离心管，加入三分之二体积的异丙醇，十分之一体积的3mol/L的乙酸钠溶液（pH=6.5），-20℃放置2-3h；

5) 在4℃条件下，10000g离心15min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀；

6) 加入50uL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即为样品DNA溶液。

也可使用等效的DNA/提取试剂盒。

油脂样本请直接选用市售油脂DNA/提取试剂盒，按说明操作

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

3. 加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，加入相应的

反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25ul；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）选择NONE，请勿选择ROX参比荧光。

4.3推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道35<Ct值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为35<Ct值≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；
阴性：样本检测结果Ct值>38或无Ct值。

6. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7. 质控标准

阴性质控品：Ct>38或无Ct值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，wan全混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。