详细介绍
品牌 | YLKBIO | 货号 | YLK-SH142 |
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规格 | 100T/96S | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 科研 | 应用领域 | 化工,生物产业 |
测定方法: | 微量法 |
γ-谷氨酰半胱氨/酸连接酶(GCL)测试盒说明书
微量法100T/96S
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
GCL 是 GSH 合成的限速酶,GSH 对 GCL 有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节,如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。
测定原理:
在ATP和Mg2+存在下,GCL催化谷氨/酸和半胱氨/酸合成γ-谷氨酰半胱氨/酸;同时ATP去磷酸化产生无机磷分子,通过测定无机磷增加速率,即可计算出GCL活性。
自备仪器和用品:
冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、浓硫酸和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体105mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加6 mL蒸馏水充分震荡溶解。
试剂三:粉剂×1管,4℃保存。临用前加入蒸馏水1.5 mL充分震荡溶解。
试剂四:液体7mL×1瓶,室温保存。
试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入12 mL蒸馏水,充分震荡溶解后,缓缓加入400µL浓硫酸(自备),边加边搅拌。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
GCL测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到660nm,蒸馏水调零。
2. 空白管:取1.5mLEp管,依次加入试剂一48µL、试剂二52µL、试剂三12µL和蒸馏水24µL,混匀后盖紧,37℃水浴准确反应15 min;再加入试剂四60µL,混匀后,室温(25℃左右)8000g,离心10 min,取上清100µL,加入试剂五100µL,混匀后盖紧,45℃水浴10min,冷却后测定660nm处光吸收,记为A空白管。
3. 测定管:取1.5mLEp管,依次加入试剂一48µL、试剂二52µL、试剂三12µL和上清液24µL,混匀后盖紧,37℃水浴准确反应15 min;再加入试剂四60µL,混匀后,室温(25℃左右)8000g,离心10 min,
4. 取上清100µL,加入试剂五100µL,混匀后盖紧,45℃水浴10min,冷却后测定660nm处光吸收,记为A测定管。
注意:空白管只需要测定一次。
GCL活性计算公式:
标准曲线:y=0.1427x,R2=0.9987
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃下,每毫克蛋白每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(μg/min /mg prot)=[(A测定管-A空白管)÷0.1427×V反总]÷(Cpr×V样)÷T
=3.815×(A测定管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃下,每克组织每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为为1个酶活单位。
GCL(μg/min /g 鲜重)= [(A测定管-A空白管)÷0.1427×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
= 3.815×(A测定管-A空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:37℃下,每104个细胞每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(μg/min /104 cell)=[(A测定管-A空白管)÷ 0.1427×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 3.815×(A测定管-A空白管)÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
活性单位定义:37℃下,每毫升液体每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(μg/min /mL)= [(A测定管-A空白管)÷ 0.1427×V反总]÷V样÷T
= 3.815×(A测定管-A空白管)
0.1427:回归方程系数;V反总:反应总体积(mL)196 µL=0.196 mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL; V样:加入反应体系中上清液体积,24µL =2.4×10-2 mL;V样总:提取液体积,1 mL;W:样本质量,g;T:反应时间:15min。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.07135x,R2=0.9987
((1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃下,每毫克蛋白每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(μg/min /mg prot)= [(A测定管-A空白管)÷0.07135×V反总]÷(Cpr×V样)÷T
=7.63×(A测定管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃下,每克组织每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为为1个酶活单位。
GCL(μg/min /g 鲜重)= [(A测定管-A空白管)÷0.07135×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
= 7.63×(A测定管-A空白管)÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:37℃下,每104个细胞每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(μg/min /104 cell)=[(A测定管-A空白管)÷0.07135×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 7.63×(A测定管-A空白管)÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
活性单位定义:37℃下,每毫升液体每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(μg/min /mL)= [(A测定管-A空白管)÷0.07135×V反总]÷V样÷T
=7.63×(A测定管-A空白管)
0.07135:回归方程系数;V反总:反应总体积(mL)196 µL=0.196 mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL; V样:加入反应体系中上清液体积,24µL =2.4×10-2 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间:15min。
注意事项:
(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,以免影响其活力。如果是匀浆液,避免反复冻融。
(2)所有试剂配制完后,除表明4℃保存外,请于1天内用完。
(3)实验过程请带手套,试剂三中有强腐蚀性物质,注意不要溅到皮肤上或眼睛内。
(4)测定吸光值时请于水浴后10~40分钟内测完。
(5)样本测定前先取1-2个样做预实验,如吸光值太高,应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数,使得吸光值在标准曲线范围内,哺乳动物组织和血液一般稀释3~5倍。
(6)试剂三配制过程中,可能会产生黑色固体,其不影响结果,注意吸取时不要将黑色固体吸入。
(7)细胞中GCL活性测定时,细胞数目须在300万-500万之间,细胞中GCL的提取时可加试剂一(或生理盐水)后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。
γ-谷氨酰半胱氨/酸连接酶(GCL)测试盒仅供科研!
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